Archiv pro měsíc: Září 2020

AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism)

AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism)

Princip

Jde o restrikční metodu, která umožňuje analýzu polymorfismu v celkové genomové DNA a nevyžaduje znalosti o struktuře geonomu (specifické primery apod.). DNA je štěpena dvěma různými restrikčními enzymy a z velkého množství vzniklých fragmentů je pomocí dvou následných PCR selektována část fragmentů. (desítky až stovky). Sleduje se přítomnost nebo nepřítomnost fragmentu určité délky.

AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism)
AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism)

Prvním krokem AFLP metody je restrikce. Pro štěpení DNA se používají restriktasy MseI a EcoRI, které štěpí DNA řetězec tzv. s přesahem, tj. na koncích fragmentů vznikají jenovláknové přesahy několika bazí. Na tyto volné konce se komplementárně vážou tzv. adaptory, krátké syntetické úseky dvouřetězcové DNA o známé sekvenci. Spojení adaptorů s konci restrikčních fragmentů zajišťuje enzym T4 DNA ligasa. Následuje tzv. preselektivní amplifikace, kdy PCR reakce probíhá s dvojicí primerů, které mají sekvenci komplementární k sekvenci adaptorů a obsahují jednu tzv. selektivní bázi navíc (obecně se používá C pro MseI primer a A pro EcoRI primer). Výsledkem PCR jsou fragmenty s MseI adaptorem na jednom konci a EcoRI adaptorem na druhém konci. Díky prodloužení o jednu selektivní bázi vzniká pouze 1/16 restrikčních fragmentů. Preselektované fragmenty vstupují do druhé, tzv. selektivní PCR, ve které jsou použity primery komplementární k adaptorům prodloužené o tři selektivní báze (C + dvě náhodně zvolené báze pro MseI a A + dvě náhodně zvolené báze pro EcoRI). Tím je počet fragmentů znovu redukován. EcoRI primery jsou fluorescenčně značené, což umožňuje separaci fragmentů v automatickém sekvenátoru tzv. fragmentační analýzou. Fragmenty jsou rozděleny podle délky, jejíž přesné určení umožní přidání fluorescenčně značeného standardu obsahujícího fragmenty DNA o známé délce ke každému vzorku.

Obvykle se hledá několik primerových kombinací, které pak budou odlišeny různou fluorescenční barvou EcoRI primeru a mohou být na sekvenátoru analyzovány zároveň ve směsných vzorcích. Automatický sekvenátor ABI PRISM 3130xl firmy Applied Biosystems umožňuje současně analýzu čtyř různých primerových kombinací.

několik primerových kombinací
několik primerových kombinací

Díky možnosti detekovat variabilitu na nízkých úrovních lze AFLP použít pro studium procesů v populacích, odlišení blízkých taxonů, při fylogeografických studiích apod. Existují ale i práce využívající AFLP pro studium fylogeneze i na rodové úrovni. Nevýhodou metody je poměrně vysoká cena, časová náročnost metody i požadavky na kvalitu DNA a přesné reakční podmínky při restrikci i PCR.

V současnosti je možné v naší laboratoři použít dva protokoly:

A) Protokol s využitím AFLP kitů od firmy Invitrogen

Sekvenační centrum vyžaduje pro fragmentační analýzu
Sekvenační centrum vyžaduje pro fragmentační analýzu

Obecné poznámky:

  • Sekvenační centrum vyžaduje pro fragmentační analýzu, aby byl výsledný počet vzorků v násobcích 16.
  • Během celého postupu pracujeme stále na ledu. Enzymy vyndáváme z mrazáku až těsně před jejich použitím a ihned poté vracíme zpět.
  • Fluorescenčně značené primery chráníme před světlem (zkumavky obalujeme alobalem a necháváme rozmrzat např.v tmavé skříni). Pro práci používáme alikvoty.

1) Restrikce

  • Využijeme AFLP® Core Reagent Kit I.
  • Připravíme si restrikční směs pro patřičný počet vzorků + 1. Výsledný objem směsi je 2,5 µl na vzorek.
    • sterilní H2O……………………………. 1,1 µl
    • 5× Reaction buffer………………….. 1,0 µl
    • EcoRI/MseI enzyme mixture……. 0,4 µl
  • Směs promícháme, krátce centrifugujeme a rozpipetujeme po 2,5 µl do PCR stripů nebo 0,2 ml PCR zkumavek.
  • Přidáme 2,5 µl DNA (koncentrace 50–100 ng/µl); výsledný objem 5 µl. Promícháme, krátce centrifugujeme na stolní centrifuze.
  • Vložíme do termocykleru a inkubujeme 3 hodiny při teplotě 37°.

2) Ligace

    • Využijeme AFLP® Core Reagent Kit I.
    • Připravíme si restrikční směs pro patřičný počet vzorků + 1. Výsledný objem směsi je 5 µl na vzorek.
      • Adaptor/Ligation Solution ………. 4,8 µl
      • T4 DNA ligase ………………………. 0,2 µl
    • Směs promícháme, krátce centrifugujeme a přidáme po 5 µl ke vzorkům po restrikci; celkový objem 10 µl.
    • Vložíme do termocykleru a spustíme restrikci: 12 hodin při teplotě 37°.

Pozn.: Nejlépe spustit odpoledne a nechat proběhnout přes noc, aby bylo možné ráno pokračovat preselektivní amplifikací.

  • Po proběhnutí reakce otestujeme úspěšnost restrikce/ligace na 1,8 % agarosovém gelu v TBE pufru. Nanášíme 3–5 µl směsi po ligaci spolu se 3 µl LB a 3 µl 100 bp ladderu. Na gelu by měl být vidět „smír“ restrikčních fragmentů (zejména v oblasti 50–1000 bp).

    preamplifikační směs
    preamplifikační směs

3) Preselektivní amplifikace

  • Využijeme AFLP® Pre-amp Primer Mix I .
  • Připravíme si preamplifikační směs pro patřičný počet vzorků + 1. Výsledný objem směsi je 5 µl.
    • PA mix …………………………………… 4 µl
    • PCR buffer (10×)……………………. 0,5 µl
    • DNA polymerasa (1 U/µl)……….. 0,1 µl
  • Směs promícháme, krátce centrifugujeme, a rozpipetujeme po 4,6 µl do PCR stripů nebo 0,2 ml PCR zkumavek.
  • Přidáme 0,4 µl DNA po ligaci; výsledný objem 5 µl.
  • Vložíme do termocykleru a spustíme program pro preselektivní amplifikaci:
1× 72°C 2 min
20× 94°C 1 s
56°C 30 s
72°C 2 min ramping 2°C/s
1× 60°C 30 min
1× 10°C hold
  • Směs po preselektivní amplifikaci naředíme 10× naředíme (2 µl preamplifikační směsi + 18 µl sterilní H2O). Zbytek nenaředěného vzorku uschováme v –20°C pro případné opakování.
  • Úspěšnost preselektivní amplifikace ověříme na 1,8 % agarosovém gelu v TBE pufru. Nanášíme 3 µl (neředěné) preamplifikační směsi spolu s 3 µl LB a 3 µl 100 bp ladderu. Na gelu by měl být vidět „smír“ preamplifikačních fragmentů, na několika místech intenzivnější.

    Směs po preselektivní amplifikaci
    Směs po preselektivní amplifikaci

4) Selektivní amplifikace

  • Připravíme si mix pro odpovídající počet vzorků + 1. Obvykle děláme pro každý vzorek 4 varianty, které se liší použitými primery (neznačený MseI a fluorescenčně značený EcoRI). Výsledný objem směsi je 7,5 µl na jeden vzorek v jedné variantě.
    • Sterilní H2O …………………………… 5,1 µl
    • PCR buffer (10x)……………………… 1 µl
    • dNTP (10 mM) ………………………. 0,2 µl
    • EcoRI primer (1 pmol/µl)………… 0,5 µl
    • MseI primer (5 pmol/µl) …………. 0,5 µl
    • DNA polymerasa (1 U/µl)……….. 0,2 µl
  • Směs promícháme, krátce centrifugujeme a rozpipetujeme po 7,5 µl do PCR stripů nebo 0,2 ml PCR zkumavek.
  • Přidáme 2,5 µl ředěné DNA po preselektivní amplifikaci, výsledný objem směsi 10 µl.
  • Promícháme, krátce centrifugujeme na stolní centrifuze.
  • Vložíme do cykleru a spustíme program pro selektivní amplifikaci:
1× 94°C 2 min
65°C 30 s
72°C 2 min ramping 2°C/s
8× 94°C 1 s
64-56°C 30 s touch-down by 1°C
72°C 2 min ramping 2°C/s
23× 72°C 1 s
56°C 30 s
72°C 2 min ramping 2°C/s
1× 60°C 30 min
1× 10°C hold

5) Příprava pro fragmentační analýzu

  • Připravíme směs produktů selektivní amplifikace, které pocházejí z jednoho původního vzorku (jedné směsi po preamplifikaci), ale liší se fluorescenční barvou. Smícháme po 1 µl (nebo optimalizované objemy) od každé ze čtyř barev.
  • Pokud není možné odnést vzorky na fragmentační analýzu v krátké době, přesrážíme selektivní PCR produkt octanem sodným (viz protokol C).
  • Připravíme si mix pro patřičný počet vzorků + 1. Formamid je v laboratoři k dispozici v alikvotech pro přípravu 17 vzorků. Výsledný objem směsi je 10,5 µl na vzorek.
    • Hi-Di formamid………………………………. 10,25 µl
    • GeneScan 500LIZ Size standrad…………..0,25 µl
  • Ke směsi přidáme 0,5 µl smíchané DNA po selektivní amplifikaci. Takto připravené vzorky ihned odneseme do sekvenančního centra na fragmentační analýzu.

 

B) Protokol bez využití AFLP kitů

 

  • Obecné poznámky viz protokol A.
  • ATP je skladováno při –80°C, proto potřebné množství necháme rozmrznout v předstihu.

1) Restrikce

  • DNA naředíme TE pufrem tak, abychom měli 50 ng DNA v celkovém objemu 40 µl.
  • Připravíme si restrikční směs pro patřičný počet vzorků + 1. Výsledný objem směsi je 10 µl na vzorek.
    • R/L buffer (koncentrace 10x)……………….. 5 µl
    • sterilní H2O……………………………………… 4,25 µl
    • EcoRI (koncetrace 20U/µl) ……………….. 0,25 µl (= 5 U)
    • MseI (10U/µl)…………………………………….0,5 µl (= 5 U)
  • Směs promícháme a rozpipetujeme po 10 µl do PCR stripů nebo 0,2 ml PCR zkumavek.
  • Přidáme 40 µl DNA, výsledný objem 50 µl. Promícháme, krátce centrifugujeme na stolní centrifuze.
  • Vložíme do cykleru a inkubujeme 16 hodin při teplotě 37°C

Pozn.: Nejlépe spustit odpoledne a nechat proběhnout přes noc, aby bylo možné ráno pokračovat ligací.

2) Ligace

  • Připravíme si ligační směs pro odpovídající počet vzorků + 1.
  • Výsledný objem směsi je 10 µl na vzorek.
    • sterilní H2O………………………………………. 6,2 µl
    • R/L buffer (koncentrace 10x)……………….. 1 µl
    • EcoRI 3’ adaptor (50 pmol/µl) ……………. 0,1 µl (= 5 pmol)
    • EcoRI 5’ adaptor (50 pmol/µl) ……………. 0,1 µl (= 5 pmol)
    • MseI 3’ adaptor (250 pmol/µl) ……………. 0,2 µl (= 50 pmol)
    • MseI 5’ adaptor (250 pmol/µl) ……………. 0,2 µl (= 50 pmol)
    • ATP (10 mM)……………………………………. 1,2 µl (= 1,2 pmol)
    • T4 ligasa (1 U/µl)………………………………… 1 µl = 1 U
  • Směs promícháme a rozpipetujeme po 10 µl do PCR stripů nebo 0,2 ml PCR zkumavek.
  • Přidáme 50 µl DNA po restrikci. Výsledný objem ligační směsi je 60 µl.
  • Promícháme, krátce centrifugujeme na stolní centrifuze.
  • Vložíme do cykleru a spustíme program pro ligaci: 3 hodiny při 37°C.
  • Po proběhnutí reakce otestujeme úspěšnost restrikce/ligace na 1,8 % agarosovém gelu v TBE pufru. Nanášíme 10 µl směsi po ligaci spolu se 3 µl LB a 3 µl 100 bp ladderu. Na gelu by měl být vidět „smír“ restrikčních fragmentů (zejména v oblasti 50–1000 bp).
  • Směs po ligaci 10x naředíme (5 µl ligační směsi + 45 µl T0.1E pufru).
  • Zbytek nenaředěného vzorku po ligaci uschováme v –20°C pro případné opakování (naředěných 50 µl stačí pro 10 preamplifikačních reakcí).

3) Preselektivní amplifikace

  • Připravíme si mix pro patřičný počet vzorků + 1. Výsledný objem směsi je 45 µl na vzorek.
    • Sterilní H2O …………………………………….. 30,5 µl
    • PCR buffer (10x)………………………………… 5 µl
    • MgCl2 (25 mM)………………………………….. 8 µl (= 4 mM)
    • dNTP (10 mM) …………………………………… 1 µl (= 0.2 mM)
    • EcoRI+A primer (500 ng/µl)……………… 0,15 µl (= 75 ng)
    • MseI+C primer (500 ng/µl) ……………….. 0,15 µl (= 75 ng)
    • DNA polymerasa (5 U/µl)………………….. 0,2 µl (= 1 U)
  • Směs promícháme a rozpipetujeme po 45 µl do PCR stripů nebo 0,2 ml PCR zkumavek.
  • Přidáme 5 µl naředěné DNA po ligaci. Výsledný objem směsi je 50 µl.
  • Promícháme, krátce centrifugujeme na stolní centrifuze.
  • Vložíme do cykleru a spustíme program pro preselektivní amplifikaci:
1× 94°C 1 min
30× 94°C 30 s
60°C 30 s
72°C 60 s ramping 1°C/s
1× 72°C 9 min
1× 10°C hold
  • Úspěšnost preselektivní amplifikace ověříme na 1,2 % agarosovém gelu v TBE pufru. Nanášíme 10 µl preamplifikační směsi spolu s 3 µl LB a 3 µl 100 bp ladderu. Na gelu by měl být vidět „smír“ preamplifikačních fragmentů, na několika místech intenzivnější.
  • Směs po preselektivní amplifikaci 20× ředíme (5 µl preamplifikační směsi + 95 µl TE pufru). Zbytek nenaředěného vzorku uschováme v –20°C pro případné opakování.

    Úspěšnost preselektivní amplifikace
    Úspěšnost preselektivní amplifikace

4) Selektivní amplifikace

  • Připravíme si mix pro odpovídající počet vzorků + 1. Obvykle děláme pro každý vzorek 4 sady vzorků, které se liší použitými primery (neznačený MseI a fluorescenčně značený EcoRI). Výsledný objem směsi je 7,5 µl na jeden vzorek v jedné sadě.
    • Sterilní H2O ……………………………………… 4,5 µl
    • PCR buffer (10x)………………………………… 1 µl
    • MgCl2 (25 mM)………………………………… 0,6 µl (= 1,5 mM)
    • dNTP (10 mM) …………………………………. 0,2 µl (= 0.2 mM)
    • MseI+CNN primer (300 ng/µl) …………… 0,1 µl (= 30 ng)
    • EcoRI+ANN primer (5 ng/µl) ………………. 1 µl (= 5 ng)
    • DNA polymerasa (5 U/µl)………………….. 0,1 µl (= 0,5 U)
  • Směs promícháme, krátce centrifugujeme a rozpipetujeme po 7,5 µl do PCR stripů nebo 0,2 ml PCR zkumavek.
  • Přidáme 2,5 µl ředěné DNA po preselektivní amplifikaci, výsledný objem směsi je 10 µl.
  • Promícháme, krátce centrifugujeme na stolní centrifuze.
  • Vložíme do cykleru a spustíme program pro selektivní amplifikaci:
1× 94°C 2 min
10× 94°C 30 s
65-56°C 30 s touch-down by 1°C
72°C 60 s ramping 1°C/s
25× 72°C 9 min
56°C 30 s
72°C 60 s ramping 1°C/s
1× 72°C 15 min
1× 10°C hold
směs produktů selektivní amplifikace
směs produktů selektivní amplifikace

5) Příprava pro fragmentační analýzu

  • Připravíme směs produktů selektivní amplifikace, které pocházejí z jednoho původního vzorku (jedné směsi po preamplifikaci), ale liší fluorescenční barvou. Smícháme po 1 µl (nebo optimalizované objemy) od každé ze čtyř barev.
  • Pokud není možné odnést vzorky na fragmentační analýzu v krátké době, přesrážíme selektivní PCR produkt octanem sodným (viz protokol C).
  • Připravíme si mix pro patřičný počet vzorků + 1. Formamid je v laboratoři k dispozici v alikvotech pro přípravu 17 vzorků. Výsledný objem směsi je 10,5 µl na vzorek.
    • Hi-Di formamid………………………………. 10,25 µl
    • GeneScan 500LIZ Size standrad…………..0,25 µl
  • Ke směsi přidáme 0,5 µl smíchané DNA po selektivní amplifikaci. Takto připravené vzorky ihned odneseme do sekvenančního centra na fragmentační analýzu.

 

C) Přesrážení octanem sodným

 

Všechny centrifugační kroky probíhají při 4°C v předem vychlazené centrifuze.

  • Na stěnu 1,5 ml eppendorfky pipetujeme 1 µl 3M octanu sodného.
  • Do kapky octanu sodného přidáme 3 µl směsi DNA po selektivní amplifikaci.
  • Přidáme 25 µl čistého 96% ethanolu.
  • Promícháme na vortexu, krátce stočíme na stolní centrifuze.
  • Necháme stát 20 min v mrazáku při –20°C.
  • Centrifigujeme 30 min při 14 000 rpm. Eppendorfky v centrifuze orientujeme do stejné pozice, abychom měli DNA usazenou vždy na stejném místě.
  • Pomalu a opatrně slijeme supernatant, DNA zůstává usazená na stěně eppendorfky.
  • Přidáme 100 µl 70% ethanolu.
  • Centrifigujeme 5 min při 14 000 rpm.
  • Pomalu a opatrně slijeme supernatant, DNA zůstává na stěně eppendorfky.
  • Otevřené eppendofky necháme stát ve stojánku 5 min při laboratorní teplotě a následně dosušíme 10 min v termobloku při 65°C.
  • Skladujeme v lednici (4°C).
  • Před přípravou pro fragmentační analýzu rozpustíme ve 3 µl sterilní destilované vody (nebo TE pufru).

Miami Beach je přední destinací Severní Ameriky

K Miami Beach je třeba hodně blahopřát: třpytivé město na nábřeží bylo právě díky World Travel Awards – mnohými známými jako Oscary z odvětví cestovního ruchu – pojmenováno jako hlavní destinace v Severní Americe.

Je to velká pocta a zaslouží si to vzhledem k milionům turistů, kteří každoročně sestupují na Miami Beach, aby zažili jeho „oslnivou škálu potěšení ve stylu Art Deco, rozsáhlé pláže a prskající zábavu,“ uvádí se v tiskové zprávě organizace. Ocenění, o nichž hlasovali profesionálové v oblasti cestovního ruchu, byla rozdána prakticky během ceremoniálu, který se konal minulou neděli večer.

Dalšími oblastními vítězi byli Setai, Miami Beach, zvolený jako Leading Beach Hotel; Fontainebleau Miami Beach, zvolený Leading Hotel na Floridě; a Miami Beach Visitor and Convention Authority, která zvítězila v Leading Tourism Board v roce 2020.

Miami Beach porazil dlouholetého vítěze Las Vegas, který držel titul téměř deset let, i minulých vítězů New Yorku a Orlanda, o hlavní cenu. Je to znamení dob, kdy sociální distancování na písku poráží galavanting ve světě Walta Disneye nebo v Las Vegas hledajícím potěšení – a jsme tady nebo tam.

Narconon me vrátil zpět do života

Narconon me vrátil zpět do života - Chere D
Narconon me vrátil zpět do života – Chere D

Absolventka Narcononu
Chere D.

Určitým způsobem jsem se dostala do problematické situace a zapletla jsem se do drog a se špatnými lidmi.

A cokoli kdokoli z nich dělal, hrozně jsem to chtěla taky vyzkoušet a zažít.

Cítila jsem, že musím krást peníze, abych měla na drogy. Na nikom mi nezáleželo, jenom na sobě.

A abych každé ráno vůbec vstala, potřebovala jsem drogy. Abych mohla jít do práce, musela jsem si vzít drogy.

Došlo to tak daleko, že jsem nemohla žít, když jsem nebyla sjetá.

Naštěstí můžu říct, že Narconon byl můj první a jediný rehabilitační program.

Jak postupně procházíte každým krokem programu Narconon, učíte se více nástrojů, jak se zlepšit, jak být čestný a mít osobní integritu a mít kolem sociální lidi, přemýšlet o všech cílech v životě.

Čím déle jsem byla na programu, tím víc jsem si věřila. Postupně jsem se měnila.

Dneska jsem schopná se vzbudit čistá a fungovat celý den, být plná energie, být celý den produktivní, jít do práce a pořád úplně čistá.

Cítím, že kdybych mohla překonat závislost a nikdy se na tu cestu znovu neobrátit a použít všechny nástroje, které jsem díky programu získala, udělám cokoli.

Analýza mikrosatelitů

Princip

Mikrosatelitní DNA neboli mikrosatelity, také nazývané STR (short tandem repeats – krátká tandemová opakování) nebo SSR (simple sequence repeats), jsou krátké segmenty DNA, ve kterých se mnohokrát opakují specifické motivy nukleotidových sekvencí. Nejčastěji jsou tvořeny opakováním mono-, di-, tri- nebo tetranukleotidů, např. (A)n, (AT)n, (ATA)n apod. Počet opakování jednotky (repetice) v konkrétním místě DNA (lokusu) definuje alelu. Každý jedinec má v jaderné DNA dvě kopie každého mikrosatelitu, jeden zděděný po matce, druhý po otci. U diploidních jedinců tak můžeme odhalit dvě alely, u tetraploidních až čtyři atd.

Mikrosatelitní DNA
Mikrosatelitní DNA

Délku alel(y) zjistíme PCR amplifikací daného lokusu pomocí primerů přiléhajících k mikrosatelitní sekvenci. Pro analýzu mikrosatelitů tedy potřebujeme znát okolní sekvence. PCR fragmenty pak rozdělíme podle délky v automatickém sekvenátoru tzv. fragmentační analýzou. Ke každému vzorku se přidá fluorescenčně značený standard (500-LIZ), obsahující fragmenty DNA o známé délce, aby bylo později možné identifikovat délku každého fragmentu (alely) a jednoznačně ji srovnávat s délkou fragmentů v jakémkoliv jiném běhu.

short tandem repeats – krátká tandemová opakování
short tandem repeats – krátká tandemová opakování

Mikrosatelity jsou považovány za jedny z nejvhodnějších genetických markerů díky jejich hojnému výskytu v celém genomu, extrémní variabilitě (polymorfismu) a kodominantní dědičnosti (umožňuje rozlišit heterozygoty). V populační biologii nachází využití při identifikaci příbuzných jedinců, až po odvozování demografických parametrů.

Jaderné mikrosatelity jsou často velmi druhově specifické, musíme tedy pracovat s druhem, pro nějž jsou primery již publikované. Používají se na vnitrodruhové úrovni. Chloroplastové mikrosatelity se naopak vyskytují v místech mezi konzervovanými sekvencemi. Na základě tzv. konsenzuálních primerů můžeme určité lokusy amplifikovat pro druhy z mnoha různých čeledí. Jsou tedy využitelné pro hodnocení variability mezi druhy.

Chloroplastové mikrosatelity
Chloroplastové mikrosatelity

Postup

1) PCR

Pro amplifikaci konkrétního úseku DNA, který obsahuje repetitivní mikrosatelitovou sekvenci použijeme dva specifické primery, jeden z primerů je fluorescenčně značený (používáme barvy 6-FAM, VIC, NED a PET).

analyzovat více mikrosatelitových lokusů
analyzovat více mikrosatelitových lokusů

Pokud je třeba analyzovat více mikrosatelitových lokusů (často se analyzuje 8-10), je výhodné pokusit se sestavit tzv. multiplex PCR. Je to v podstatě běžná PCR reakce, do které přidáme více primerových páru najednou a amplifikujeme tak více lokusů (až třeba pět) v jedné PCR reakci. Můžeme tak výrazně snížit finanční i časové náklady na analýzu. Pro úspěšnou a dostatečnou amplifikaci všech lokusů musíme zaručit, aby (1) primery měly přibližně stejnou teplotu annealingu, (2) primery v jedné PCR reakci nevytvářely dimery, (3) lokusy s překrývajícím se rozsahem předpokládaných délek fragmentů byly označeny jinou fluorescenční barvou.

Příprava pro fragmentační analýzu
Příprava pro fragmentační analýzu
  • Do 1.5 ml eppendorfky napipetujeme směs pro příslušný počet vzorků + 1. Pracujeme stále na ledu.
    • sterilní Milli-Q voda ……………………. 5,7 µl
    • 2 × Plain PP Master Mix (Top-Bio).. 7,5 µl
    • forward primer (10 pmol/µl) ………. 0,4 µl
    • reverse primer (10 pmol/µl) ………… 0,4 µl
  • Promícháme na vortexu, krátce stočíme v centrifuze a po 14 µl pipetujeme do PCR zkumavek (případně stripů).
  • Přidáme 1 µl naředěné DNA (5 ng/µl), promícháme na vortexu a vložíme do termocykleru s příslušným teplotním programem.
  • Po proběhnutí reakce otestujeme úspěšnost amplifikace na 1% agarosovém gelu v TBE pufru.

Příprava pro fragmentační analýzu

  • Připravíme směs osahující 0,25 µl velikostního standardu (Size standard, 500-LIZ), 0,5 µl od každého PCR produktu a doplníme deionizovaným formamidem (tzv. Hi-Di formamid = high deionized) na výsledný objem 10 µl.
  • Postupujeme tak, že si nejprve připravíme směs formamidu a velikostního standardu pro příslušný počet vzorků +1.
  • Promícháme, krátce stočíme, a rozpipetujeme do označených 0,5 ml eppendorfek.
  • Přidáme PCR produkt(y).
  • Promícháme na vortexu, krátce stočíme v centrifuze a odneseme do sekvenního centra

V oblasti Stavropol vstoupilo na Agrární univerzitu 973 studentů

Nevídaný počet dětí se letos zúčastnil VIII. Regionální olympiády studentských produkčních týmů. Výsledkem je, že 70 vítězů a oceněných získá další body při přijetí na Státní agrární univerzitu ve Stavropolu.

V oblasti Stavropol vstoupilo na Agrární univerzitu 973 studentů
V oblasti Stavropol vstoupilo na Agrární univerzitu 973 studentů

8. dubna na Agrární univerzitě, kde věděli, jak vřele přivítat hosty, čekali na příchod velmi mladých budoucích zemědělců. Na adresu registrace univerzity dorazila řada autobusů – v Zootechnichesky Lane, 12.

Správa Stavropolu bude jednat u Nejvyššího soudu proti dopravcům

Zasloužená ocenění si přijali žáci z 24 teritorií Stavropolského území, nejvýznamnější na VIII. Regionální olympiádě studentských produkčních týmů, kterou každoročně pořádá nejlepší zemědělská univerzita v zemi. S úsměvem a potleskem je v montážní hale přivítali místopředsedkyně vlády na stavropolském území Irina Vladimirovna Kuvaldina, ministryně školství a mládežnické politiky na území Jevgenij Nikolajevič Kozyura a rektor Státní agrární univerzity ve Stavropolu, akademik Ruské akademie věd Vladimir Ivanovič Trukhachev. Sdělil blahopřání od guvernéra území Stavropol Vladimíra Vladimiroviče Vladimirova všem dětem a ředitelům škol, vedoucím školských oddělení okresních správ, kteří s nimi přišli, a zahájil slavnostní ceremoniál.

V oblasti Stavropol vstoupilo na Agrární univerzitu 973 studentů 2
V oblasti Stavropol vstoupilo na Agrární univerzitu 973 studentů 2

„Jsi naše naděje a naše budoucnost!“ – pak se obrátil k mladému publiku I. V. Kuvaldina. – Dnešní den je pro naše agrární území Stavropol velmi důležitou událostí. Koneckonců nikde jinde není tak úžasná olympiáda a tak bohatá historie pohybu studentských produkčních týmů jako na území Stavropolu. “ Přála si, aby děti propojily svůj život se zemědělstvím a vstoupily na Státní agrární univerzitu ve Stavropolu. E. Kozyura připomněl, že většina vedení regionu vyšla ze zdí této konkrétní univerzity, jejíž materiálně-technická základna a pedagogičtí pracovníci umožňují získat kvalitní vzdělání v různých specializacích agrární sféry.

V oblasti Stavropol onemocnělo koronavirem denně 146 lidí a 143 se uzdravilo

Rektor V. I. Truchačev dále uvedl, že olympiáda UPB v roce 2017 zahrnovala 14 soutěží: „Pěstitel rostlin“, „Ovoceřitel“, „Technolog pro hospodářská zvířata“, „Technolog pro potraviny“, „Veterinární lékař“, „Krajinář“, „Lesovod“ „Land Surveyor“, „Mechanic“, „Electric“, „Inventor and Rationalizer“, „Ecologist“, „Restorator-Hotelier“, „Tour Operator-Travel Agent“.

Z hlediska počtu účastníků olympiády UPB byly obzvláště aktivní okresy Grachevsky, Ipatovsky, Novoaleksandrovsky, Shpakovsky, Izobilnensky, Kochubeevsky. Za zmínku stojí také školy, za jejichž hradbami studuje největší počet dnešních vítězů a oceněných olympijských her. Jedná se o školu č. 17 Aleksandrovského, č. 8 Grachevského, č. 4 Izobilnenského, č. 1 okresů Kochubeevsky, stejně jako školy č. 1, 3, 9 okresu Shpakovsky.

Vedení univerzity rozhodlo: 1. místo (z hlediska počtu soutěží) získává 14 osob, 2. místo – 28 osob. a 3. – také 28 osob. Po přijetí na Agrární univerzitu získají vítězové 5 bodů, vítězové cen (kteří obsadili 2. a 3. místo) – 4, respektive 3 body.

Každému ze 70 nejlepších účastníků olympiády UPB s hodným vítězstvím osobně poblahopřál jeho budoucí rektor – doktor zemědělských věd, profesor, doktor ekonomie, profesor, akademik Ruské akademie věd, zástupce Dumy na stavropolském území, hrdina práce na stavropolském území, čestný občan na stavropolském území Vladimír Ivanovič Truevič.

„Tato olympiáda byla velmi promyšlená, zajímavá a přinesla nám všem velký užitek.“ Získali jsme neocenitelné zkušenosti s účastí v soutěžích na tak vysoké úrovni, “- podělil se o své dojmy z vysokého řečiště Dmitry Yankin, jeden z vítězů VIII. Regionální olympiády studentských produkčních týmů. On, student střední školy MBOU č. 1, okres Essentukskaya Predgorny, získal nejvyšší počet (275) bodů v soutěži „Electric“.

Vítězka soutěže „Pěstitel rostlin“, studentka střední školy MBOU č. 1 Alina Saushkina, která pocházela z okresu Kochubeevsky, ve své odpovědi přiznala: „Všechny své budoucí profesní sny spojuji se zemědělstvím, které je za podmínek sankcí a nahrazování dovozů nejslibnějším směrem v oblasti ekonomiky. Lidé potřebují kvalitní zemědělské produkty pěstované v jejich zemi. Věřím, že Stavropolská státní agrární univerzita je centrem vědy a vzdělávání, které mi pomůže uskutečnit můj sen, získat důstojné povolání a přinést Rusku maximální užitek. Olympiáda UPB se stala mým krokem do zítřka. “

Na konci slavnostního ceremoniálu nebyla ignorována pozornost regionálního vedení, katedry, ředitelů zemědělských univerzit a škol účastnících se olympiády a vedoucích kateder školství okresních správ. Spolu s děkovnými dopisy a vřelými potřesení rukou dostali všichni slova velké vděčnosti za dlouhodobou spolupráci se Státní agrární univerzitou ve Stavropolu, dobré vzdělávací vzdělání školáků a hlavně za vzdělávání budoucích zemědělců.

Region v Ázerbájdžánu, který si „užívá“ světlo a ropu

Za prvních devět měsíců tohoto roku činila celková produkce Shirvanu 526 milionů 605,5 tisíc manátu, což je o 20 procent více než loni. Produkce v průmyslových odvětvích s podílem 68,4 procenta na celkové produkci se ve srovnání se stejným obdobím loňského roku zvýšila o 13,4 procenta a činila 360 milionů 173,2 tisíc manatů.

ropa v azerbajdžánu
ropa v azerbajdžánu

Na rozvoj ekonomické a sociální sféry města na úkor všech finančních zdrojů směřovalo 11792,6 tis. Manátů do fixního kapitálu, z čehož bylo na stavební a instalační práce vynaloženo 10926,5 tis. Manátů nebo 92,7%.

Region, který si „užívá“ světlo a ropu
Region, který si „užívá“ světlo a ropu

Tato fakta vyjádřil vedoucí výkonné moci města Shirvan v Ázerbájdžánu Mardan Jamalov na zprávě o výsledcích sociálně-ekonomického rozvoje ve třetím čtvrtletí roku 2018 a budoucích úkolech, uvádí FED.az.

Bylo zjištěno, že 35,4 procent průmyslové produkce ve sledovaném období patřilo těžbě, 13,2 procent zpracování, 50,7 procent elektřiny, plynu a páry a 0,7 procent zásobování vodou. 56,9% průmyslové výroby kleslo na stát a 43,1% na soukromý sektor.

Podle zprávy vedl dynamický vývoj ekonomiky města za poslední období k dalšímu zlepšení sociální situace obyvatel a ke zvýšení jejich kupní síly. Během tohoto období dosáhl maloobchodní obrat 206 milionů 709,9 tisíc manatů, což je o 3,1 procenta více než ve stejném období loňského roku. Různé spotřební zboží v hodnotě 33 milionů 214,6 tisíc manatů bylo prodáno obyvatelstvu prostřednictvím obchodních a servisních sítí a byly použity placené služby.

Zpráva také podrobně hovořila o opatřeních přijatých v oblasti školství, zdraví, kultury, o práci prováděné za účelem zajištění zásobování obyvatel elektřinou, zemním plynem, pitnou vodou a vodou pro domácnost, organizaci zvažování a přijímání odvolání občanů.

Nakonec bylo rozhodnuto o projednávaných otázkách.

Ekonomický růst v této oblasti Ázerbájdžánu činil více než 20%

Výkonná moc okresu Zardab uspořádala schůzku o socioekonomických výsledcích za prvních devět měsíců roku 2018 a o budoucích úkolech. Schůzky zúčastnili vedoucí donucovacích orgánů, služeb, průmyslu, školství, zdravotnictví a kultury a zástupci veřejnosti.

Ekonomický růst v této oblasti Ázerbájdžánu činil více než 20%
Ekonomický růst v této oblasti Ázerbájdžánu činil více než 20%

O události podal zprávu vedoucí okresní výkonné moci Lutvali Babayev. Poznamenal, že během sledovaného období bylo v hlavních odvětvích ekonomiky regionu vyrobeno 93 596 100 manátových produktů. To je o 19 milionů 357 tisíc manatů více než ve stejném období loňského roku. Pro sklizeň roku 2018 byla pšenice vysazena na 12 915 hektarech, ječmen na 5 738 hektarech, celkem 18 653 hektarů a 60 150 tun produktů. Jedná se o nejvyšší číslo v historii regionu, o 1328 tun více než v loňském roce. Ve zmíněném období byla osiva ječmene a pšenice vysazena na 206 hektarech pro sklizeň v roce 2018 ve 3 semenných farmách působících v regionu. Z 66 hektarů bylo vyprodukováno 227 tun ječmene, výtěžek činil 34,4 kvintálů na hektar. Z 140 hektarů bylo vyprodukováno 572 tun pšenice, Produktivita byla 40,2 metrických centů. Celkem bylo vyrobeno 799 tun výrobků, produktivita činila 38,7 metrických centů.

Pro rok 2018 byla v okrese vysazena bavlna na 3232 hektarech. Za tímto účelem byla podepsána smlouva mezi Zardabskou pobočkou MKT IK LLC a Zardab-Pambig LLC (P-Agro) a 702 vlastníky půdy. Během sledovaného období bylo dodáno 1234,90 tun surové bavlny. Sbírka v současné době probíhá. V roce 2018 bylo v regionu přijato 1300 krabic (24 kilogramů a 700 gramů) kukel červů a bylo provedeno normální krmení, v důsledku čehož bylo dodáno 53 tun 880 kilogramů kukel a nejvyššího čísla bylo v republice dosaženo podruhé. Podle množství mokrých zámotků předaných podnikům zpracovávajícím zámotky v regionu Zardab dostaly měděné zpracovatelské podniky 187 000 dotací manatů, 260 700 dotací manatů ze státního rozpočtu a pouze 447 700 manatů.

Za prvních devět měsíců letošního roku dosáhl počet skotu na Zardabu 54 720 a počet ovcí a koz – 113 620. To je o 92, respektive o 259 více, ve srovnání se stejným obdobím loňského roku.

Během tohoto období poskytla výkonná moc okresu více než 22 000 manatů ve finanční a jiné pomoci rodinám mučedníků, osob se zdravotním postižením v Karabachu a Černobylu, válečných veteránů, nezletilých zbavených rodičovské péče a rodin s nízkými příjmy. Za účelem zlepšení dodávek plynu obyvatelům regionu byla dokončena plynofikace vesnic Shikhbagi a Nazarali a bylo položeno celkem 17 323 metrů plynovodu. Nedávno byl otevřen plynovod a do obou vesnic byl dodáván modrý plyn. Dodávka plynu do 37 osad v regionu tak již byla dokončena.

Během tohoto období se rozšířily terénní úpravy v regionu. Byla dokončena výstavba mateřské školky s 50 místy postavené z iniciativy Nadace Hejdara Alijeva v takzvané „32hektarové“ oblasti regionu. Byly opraveny střechy a fasády 4 bytových domů, na tyto práce bylo vynaloženo 136,8 tisíc manatů. Babek, MA Rasulzade, Fuzuli, 20. ledna, Vidadi, M. Huseyn, Chingiz Gurbanov, Ázerbájdžán, Shahriyar, M. Mushfig, Kh. Mammadov, Khatai, Z. Zarbaliyev, M. Khalilov, 450 ulic Zahida Bakirova, V parcích a ulicích ve směru na Ázerbájdžánskou ulici byly provedeny opravy v hodnotě 1 000 AZN ve výši 14 000 AZN.

Okresní středisko práce přiznalo status nezaměstnanosti pro dočasnou nezaměstnanost 3 osobám a 3 občany přidělilo dávky.

Saúdská Arábie má v úmyslu snížit ceny ropy pro Asii a USA

Cena arabské lehké ropy v Asii, která je největším regionálním trhem pro Saudi Aramco, byla snížena již druhý měsíc po sobě.

Saúdská Arábie má v úmyslu snížit ceny ropy pro Asii a USA
Saúdská Arábie má v úmyslu snížit ceny ropy pro Asii a USA

To bylo zveřejněno agenturou Interfax s odvoláním na Saudi Aramco, vlastněná společnost Saúdské Arábie.

V důsledku snížení bude saúdská ropa stát o 0,8 $ levnější než ropný koš z Ománu a Dubaje. Pro asijské zákazníky budou Arab Super Light a Arab Extra Light levnější o 1,5 USD za barel a Arab Heavy Light o 0,9 USD.

V říjnu bude pokles cen ropy pro zákazníky ze Spojených států na úrovni 0,5–0,7 USD za barel. (Zpráva)

Praha 6 – Bubeneč

Bubeneč se stal součástí Prahy v roce 1922 a nachází se na levém břehu Vltavy. Části katastrálního území jsou Císařský ostrov, Stromovka (Královská obora s Místodržitelským letohrádkem s hejtmanským letním sídlem) a Výstaviště Praha. Po vzniku Československa byla zahájena rozsáhlá bytová výstavba za účasti předních českých architektů. Na začátku dvacátého století byla kolem ulice Na Zátorce založena pozoruhodná obytná kolonie – vily architektů J. Kouly, Sucharda, Maška a mnoha dalších. Bubeneč se nachází nedaleko centra města. Díky skvělé dostupnosti je oblíbená rezidenční lokalita. Počet ambasád a dvou mezinárodních škol (British International School, o.p.s., Park Lane International School, a.s., Riverside, o.p.s.) zvyšuje prestiž tohoto místa. Nespornou výhodou je také snadný přístup na letiště Václava Havla, kam se snadno dostanete do 15 minut. V Bubeneči najdete také veškerou občanskou vybavenost, kulturní aktivity a množství zeleně, které poskytují parky „Královská obora“ a „Stromovka“.