Analýza mikrosatelitů

Princip

Mikrosatelitní DNA neboli mikrosatelity, také nazývané STR (short tandem repeats – krátká tandemová opakování) nebo SSR (simple sequence repeats), jsou krátké segmenty DNA, ve kterých se mnohokrát opakují specifické motivy nukleotidových sekvencí. Nejčastěji jsou tvořeny opakováním mono-, di-, tri- nebo tetranukleotidů, např. (A)n, (AT)n, (ATA)n apod. Počet opakování jednotky (repetice) v konkrétním místě DNA (lokusu) definuje alelu. Každý jedinec má v jaderné DNA dvě kopie každého mikrosatelitu, jeden zděděný po matce, druhý po otci. U diploidních jedinců tak můžeme odhalit dvě alely, u tetraploidních až čtyři atd.

Mikrosatelitní DNA
Mikrosatelitní DNA

Délku alel(y) zjistíme PCR amplifikací daného lokusu pomocí primerů přiléhajících k mikrosatelitní sekvenci. Pro analýzu mikrosatelitů tedy potřebujeme znát okolní sekvence. PCR fragmenty pak rozdělíme podle délky v automatickém sekvenátoru tzv. fragmentační analýzou. Ke každému vzorku se přidá fluorescenčně značený standard (500-LIZ), obsahující fragmenty DNA o známé délce, aby bylo později možné identifikovat délku každého fragmentu (alely) a jednoznačně ji srovnávat s délkou fragmentů v jakémkoliv jiném běhu.

short tandem repeats – krátká tandemová opakování
short tandem repeats – krátká tandemová opakování

Mikrosatelity jsou považovány za jedny z nejvhodnějších genetických markerů díky jejich hojnému výskytu v celém genomu, extrémní variabilitě (polymorfismu) a kodominantní dědičnosti (umožňuje rozlišit heterozygoty). V populační biologii nachází využití při identifikaci příbuzných jedinců, až po odvozování demografických parametrů.

Jaderné mikrosatelity jsou často velmi druhově specifické, musíme tedy pracovat s druhem, pro nějž jsou primery již publikované. Používají se na vnitrodruhové úrovni. Chloroplastové mikrosatelity se naopak vyskytují v místech mezi konzervovanými sekvencemi. Na základě tzv. konsenzuálních primerů můžeme určité lokusy amplifikovat pro druhy z mnoha různých čeledí. Jsou tedy využitelné pro hodnocení variability mezi druhy.

Chloroplastové mikrosatelity
Chloroplastové mikrosatelity

Postup

1) PCR

Pro amplifikaci konkrétního úseku DNA, který obsahuje repetitivní mikrosatelitovou sekvenci použijeme dva specifické primery, jeden z primerů je fluorescenčně značený (používáme barvy 6-FAM, VIC, NED a PET).

analyzovat více mikrosatelitových lokusů
analyzovat více mikrosatelitových lokusů

Pokud je třeba analyzovat více mikrosatelitových lokusů (často se analyzuje 8-10), je výhodné pokusit se sestavit tzv. multiplex PCR. Je to v podstatě běžná PCR reakce, do které přidáme více primerových páru najednou a amplifikujeme tak více lokusů (až třeba pět) v jedné PCR reakci. Můžeme tak výrazně snížit finanční i časové náklady na analýzu. Pro úspěšnou a dostatečnou amplifikaci všech lokusů musíme zaručit, aby (1) primery měly přibližně stejnou teplotu annealingu, (2) primery v jedné PCR reakci nevytvářely dimery, (3) lokusy s překrývajícím se rozsahem předpokládaných délek fragmentů byly označeny jinou fluorescenční barvou.

Příprava pro fragmentační analýzu
Příprava pro fragmentační analýzu
  • Do 1.5 ml eppendorfky napipetujeme směs pro příslušný počet vzorků + 1. Pracujeme stále na ledu.
    • sterilní Milli-Q voda ……………………. 5,7 µl
    • 2 × Plain PP Master Mix (Top-Bio).. 7,5 µl
    • forward primer (10 pmol/µl) ………. 0,4 µl
    • reverse primer (10 pmol/µl) ………… 0,4 µl
  • Promícháme na vortexu, krátce stočíme v centrifuze a po 14 µl pipetujeme do PCR zkumavek (případně stripů).
  • Přidáme 1 µl naředěné DNA (5 ng/µl), promícháme na vortexu a vložíme do termocykleru s příslušným teplotním programem.
  • Po proběhnutí reakce otestujeme úspěšnost amplifikace na 1% agarosovém gelu v TBE pufru.

Příprava pro fragmentační analýzu

  • Připravíme směs osahující 0,25 µl velikostního standardu (Size standard, 500-LIZ), 0,5 µl od každého PCR produktu a doplníme deionizovaným formamidem (tzv. Hi-Di formamid = high deionized) na výsledný objem 10 µl.
  • Postupujeme tak, že si nejprve připravíme směs formamidu a velikostního standardu pro příslušný počet vzorků +1.
  • Promícháme, krátce stočíme, a rozpipetujeme do označených 0,5 ml eppendorfek.
  • Přidáme PCR produkt(y).
  • Promícháme na vortexu, krátce stočíme v centrifuze a odneseme do sekvenního centra